Efecte citostimulatoare și citoprotectoare ale peptidelor din embrioni de pui asupra fibroblastelor umane
Gh. Mihaescu1, O. Mihaescu1, Doina Petrasincu2, M. Leabu3, F.Oancea4, R.OIinescu1
1- Laboratorul de Cercetare si Productie „Hipocrate” Bucuresti
2- Institutul „Ion Cantacuzino”, București 3 – Universitatea de Medicină și Farmacie „Carol Davila” București
4 – Institutul de Cercetări pentru Protecția Plantelor, București
5 – Institutul „Victor Babes”, București
Cuvinte cheie: efecte citostimulatoare, efecte citoprotectoare, peptide embrionare fibroblaste umane
Introducere
Acțiunea peptidelor ca biosemnal este un domeniu de interes sporit, atât din domeniul academic, cât și din domeniul farmaceutic. Un număr impresionant de lucrări și brevete legate de peptidele biosemnal au fost emise în ultimii cinci ani. De exemplu, s-a demonstrat recent că peptidele care acționează ca factori de creștere a fibroblastelor protejează țesuturile împotriva radicalilor liberi, generați de radiații [1] sau în timpul reperfuziei după ischemie [2]. De asemenea, grupul nostru a demonstrat că tratamentul cu suplimente care conțin peptide de embrioni de pui scade stresul oxidativ la pacienții vârstnici [3].
Embrioterapia (utilizarea țesuturilor sau celulelor embrionare sau fetale pentru tratamentul bolilor umane) a fost folosită, în încercarea de a încetini sau chiar de a inversa procesele de îmbătrânire, încă de la începutul medicinei clinice moderne [4]. Reacțiile Imunologice (de la alergie la șoc anafilactic) și infecțiile virale și (posibile) prionice au fost cele mai frecvente efecte secundare asociate cu grefele embrionare sau la injectarea cu suspensii de celule embrionare. Pentru a evita astfel de reacții secundare periculoase, extractele din țesuturile embrionare au fost preparate și utilizate în terapie [3,5]; ingredientul activ al unor astfel de extracte s-a dovedit a fi peptide care acționează ca semnale bioactive [5,6].
În această lucrare prezentăm efectele peptidelor dintr-un extract de embrion de pui (utilizat ca ingredient activ pe două medicamente/supliment, Humanofort și Gerontofort) asupra fibroblastelor umane cultivate in vitro.
Materiale și metode.
Extracte de embrioni de pui. Embrionul de pui a fost omogenizat cu apă distilată, degresat prin extracție în contracurent cu n-hexan și liofilizat. Pulberea rezultată a fost resuspendată în apă dublă distilată, centrifugată la 10.000 g timp de 20 de minute (pentru a evita orice deformare suplimentară a patului cromatografic de gel) și cromatografiată pe gel pe o coloană preparativă (Sephadex G-50). Compușii din fracțiile incluse în gel cromatografic (cu greutate moleculară sub 50 kD) au fost unificați și liofilizați încă o dată. Pulberea liofilizată s-a dizolvat în apă ultrapură (obținută din aparatul MilliQ-Plus), s-a centrifugat timp de 15 min la 15.000 g și s-a purificat prin cromatografie pe gel de înaltă performanță pe un aparat Pharmacia-LKB, folosind o coloană TSK G2000 SW. Coloana a fost calibrată anterior cu albumină serică bovină (67 kD), ovalbumină (42 kD), hemoglobină (18 kD) și citocrom c (12,7 kD). Gel-filtrarea s-a făcut timp de 30 min, cu apă ultrapură ca fază mobilă, la un debit de 0,5 ml pe minut. Procesul de separare a fost monitorizat UV, la două lungimi de undă diferite (220 nm și 280 nm). Au fost separate mai multe fracții: FI …Fn. Concentrația proteinei în fracția peptidică a fost măsurată cu o metodă Lowry modificată, folosind un kit Sigma (P5656). Concentrațiile testate pe fibroblast au fost următoarele: 100 ^g pentru extractul inițial și concentrație echivalentă pentru fracțiunile testate (1ng/ml).
Tulpina de celule fibroblaste umane utilizată.
A fost utilizată o tulpină de celule umane diploide românești, ICP-23, cu creștere pe mediu de cultură Eagle BME obișnuit suplimentat cu ser fetal de vițel 10%.
Proceduri de testare a extractelor embrionare.
Testele au fost efectuate pe creșterea fibroblastelor în tub Barsky de 2 ml, în prezența sau, respectiv, în absența extractelor embrionare testate. Proliferarea celulară in vitro a fost estimată folosind următoarele metode: măsurarea densității optice la 24 de ore pe parcursul unui ciclu de multiplicare de 96 de ore și numerotarea celulelor după eluția cu tripsină și colorat cu albastru de tripan 0,4%. Mortalitatea a fost estimată prin numărarea celulei cu excluderea albastrului tripan. S-au făcut două tipuri de experimente. În primul, extractul embrionar a fost testat pe celule tinere (pasajul 20 … 23) și pe celule senescente (trecerea 40 … 43) în medii de cultură complete, inclusiv serul fetal de vițel. Al doilea tip de experimente, extractul de embrion de pui (GEE) a fost testat pe medii de cultură incomplete (fără ser fetal de vițel) în încercarea de a înlocui sursele factorilor de creștere.
Teste de încorporare a timidinei tritiate.
Pentru a extinde studiile asupra efectelor extractelor embrionare asupra celulelor fibroblaste sa realizat un experiment de încorporare a timidinei tritiate. Mediul de cultură a fost radiomarcat cu timidină tritiată în doză de 1 ji Ci/ml, după 48 de ore de creștere a celulei fibroblaste (aproximativ 105 celule/ml) pe monostrat în vas Kole (tratată sau nu cu extract embrionar, conform procedurii experimentale). Celula a fost recuperată din monostrat Kole după alte 24 de ore de creștere în mediu radiomarcat, centrifugată 5 min la 1.000 g, spălată de două ori cu mediu de cultură (fără ser de vițel foetai) și resuspendată în 5 % soluție tricloracetică (TCA) în apă (g/v). Suspensia de celule în TCA 5% a fost menținută 24 de ore la 4°C și centrifugata la 2500 g. În supernatant, radioactivitatea acizilor nucleici care încorporează timidina radiomarcată a fost măsurată folosind tehnici de scintilație lichidă (cu un contor de scintilație lichid Berthold 5000/300). Au fost studiate aceleași variații experimentale ca cele menționate mai sus (medii de cultură complete și medii de cultură de substituție GEE).
Rezultate si discutii.
Extractul total de extract de embrion de pui (CCE) se dovedește a exercita un: efecte citostimulatoare asupra celulelor fibroblaste tinere (pasajul 20 in vitro). După 96 de ore numărul de celule este mai mare cu 36% (martor – 17,27. 104 celule/ml, probe tratate CCE – 23,60 .104 celule/ml). În același timp, mortalitatea v 1 la 96 de ore a probelor tratate cu CCE (1,50%) este cu 50,8% mai mică decât la martor (2,95%).
Aceleași efecte se observă și asupra celulelor senescente fibroblaste tratate cu CCE (pasajul 40 in vitro) – Fig 2. Activitatea stimulatoare (Fig. 2 a) este mai puțin importantă (23%) și, de asemenea, efectul protector pare a fi mai mic (40,11). % la 48h) – Fig. 2b. Totuși, dacă luăm în considerare valorile absolute ale mortalității, vom constata că efectul protector este foarte semnificativ la 96 de ore (martor – mortalitate 7,0%; probele tratate cu CCE – mortalitate 2,86%, mai puțin egală decât mortalitatea la control. pentru celule tinere!).
Datele din Fig. 3a și 3b arată că activitatea stimulatoare pare să fie localizată în fracția F2 și doar o parte din acțiunea citoprotectoare rămâne în fracțiunea F1. După 96 de ore numărul de celule (pasajul 22 in vitro) este mai mare cu 10% în mediu tratat cu F2 (martor -14,9, 104 celule/ml, probe tratate CCE – 16,41,104 celule/ml). În același timp, mortalitatea probelor tratate cu F2 (1,67%) este cu 63,46% mai mică decât la martor (4,58%). La lotul tratat cu F1 activitatea stimulatoare nu este prezentă, dar s-a stabilit o acţiune citoprotectoare semnificativă (mortalitatea martor – 4,58%; mortalitatea F1 – 2,60%).
Aceleași efecte sunt observate și pe celulele senescente fibroblaste tratate cu F1 și F2 (pasajul 42 in vitro) – Fig. 4a și Fig. 4b. Activitatea stimulatoare (Fig. 4a) este localizata in fractiunea F2 (martor – 8,8.104 celule/ml la 96 h; F2 -11.0.104 celule/ml la 96 h) iar efectul protector pare a fi localizat in atât F1 cât și F2 (mortalitate martor – 5,32%; mortalitate F1 -1,21; mortalitate F2 -2,43%).
Rezultatele prezentate în fig. 1b, ca procent, poate fi explicat în alt mod: ca raport între mortalitatea celulară a extractului embrionar F2, față de control. La 24 de ore, mortalitatea oferită de F2 acest turn de 1/4 ori controlează apoi; de 5,7 ori mai mic decât controlul: de 5,7 ori la 48 de ore; De 2,6 ori la 72 de ore și de 1,9 ori la 96 de ore.
Evident, prin compararea acestor indicații, vârful de protecție s-a obținut la 24 de ore, apoi scade încet, cât mai mic la 96 de ore, din cauza consumului de peptide active implicate în diviziunea celulară stimulată.
Datele obținute pentru încorporarea timidinei tritiate se corelează cu datele obținute cu numărarea celulelor clasice (fila 1). Extractul de embrion de pui (GEE) stimulează încorporarea timidinei radiomarcate (tab.2), iar această activitate stimulatoare pare să fie localizată predominant în fracția F2 (tab.3). Interesant, fracția F2 a fost stabilită a fi mai stimulatoare decât extractul total pentru celulele fibroblaste senescente (pasajul 40 … 42 in vitro). Înlocuirea serului fetal cu CCE sau cu componentele acestuia nu favorizează încorporarea timidinei tritiate (tab.4).
Tab.1. Creșterea celulară, ca mortalitate celulară pentru celula fibroblastă umană ICP-23 (pasajul 23 in vitro) cultivată pe mediu cu substitut de ser fetal de vițel cu peptide de embrioni de pui (fracțiunea F2)
Valoarea urmată de aceeași literă nu diferă semnificativ pentru P<0,05% Tab. 2. Încorporarea timidinei tritiate de către celula fibroblastă umană ICP-23 tratată cu extract de embrion de pui Valoarea urmată de aceeași literă nu diferă semnificativ pentru P<0,05% Tab. 3. Încorporarea timidinei radiomarcate de către celula fibroblastă umană ICP-23 tratată cu componenta extractului de embrion de pui Valoarea urmată de aceeași literă nu diferă semnificativ pentru P<0,05% Tab.4. Încorporarea timidinei marcate radioactiv de către celula fibrobalst umană ICP-23 (pasajul 23 in vitro) cultivată pe mediu cu substitut de ser fetal de vițel cu peptide de embrioni de pui (fracțiunea F2) Valoarea urmată de aceeași literă nu diferă semnificativ pentru P<0,05% Efectul citostimulator și citoprotector a fost demonstrat pentru extractul embrionar total utilizat ca ingredient activ în medicamentele românești Humanofort și Gerontofort. Aceste efecte par să fie localizate predominant în fracția F2 (peptidă) și constau în primul rând într-un răspuns îmbunătățit la factorii de creștere din mediul de cultură celulară. În mediile fără ser fetal, activitatea citostimulatoare nu este prezentă, deci se sugerează doar un efect de răspuns crescut la alți factori de creștere. Aceeași creștere a răspunsului la factorii de creștere a fost stabilită pentru un alt extract embrionar [6], extractul CLP, făcut din făt de oaie. Experimentul a fost realizat în culturi de fibroblaste senescente de hamster care s-au apropiat de starea postmitotică in vitro; reacția la factorii de creștere este restabilită la expunerea la extractele de celule embrionare de oaie CLP. S-a sugerat că este prezent un factor(i) de activare a celulei senescente SCAF(i). țesuturile embrionare și acea substanță(ele) embrionară(e) refac receptorii factorului de creștere. Datele noastre susțin aceeași interpretare. În țesuturile embrionare, factorii care acționează asupra receptorilor specifici îi fac mai sensibili și amplifică răspunsul de celule. Este posibil să se speculeze că acești factori embrionari hipotetici vor acționa prin menținerea/refacerea celor mai adecvate structuri spațiale ale receptorilor. Lucrări suplimentare pentru îmbogățirea, purificarea și caracterizarea factorilor responsabili din țesuturile embrionare sunt în curs. Activitatea citoprotectoare a extractelor embrionare ar putea fi în relație cu protecția împotriva radicalilor liberi exercitată de diferiții Growth Factors, factori de creștere (peptide/peptides). După cum sa menționat deja, sa demonstrat recent că peptidele care acționează ca factori de creștere a fibroblastelor protejează țesuturile împotriva radicalilor liberi, generați de radiații [1] sau în timpul reperfuziei după ischemie [2]. Grupul nostru a demonstrat că tratamentul cu suplimente/medicamente care conțin peptide de embrioni de pui scade stresul oxidativ la pacienții vârstnici [3]. Aceeași protecție împotriva radicalilor liberi poate fi sugerată în cultura celulară, dar sunt necesare lucrări viitoare.
Pe lângă aceasta, s-a dovedit că radicalii liberi de oxigen sunt implicați în modularea profilării fibroblastelor [7]. Un posibil efect al peptidelor embrionare asupra sistemului biologic care acționează asupra formulării radicalilor liberi sau care acționează ca si captator de radicali liberi va influența (indirect) profilarea fibroblastelor. În concluzie, datele noastre prezentate aici susțin ideea că extractul embrionar ca ingredient activ utilizat extras prin metoda noastra patentata are efecte citostimulatoare și citoprotectoare.
